北京 — 研究チームは、小イントロダクターRNA（siRNA）を用いてポロライクキナーゼ1（PLK1）遺伝子をサイレンスし、膠質腫瘍の成長を抑える新しいナノ粒子送達システムを開発した。研究者らは、このPAH-AM-PEG-ApoEキャリアをPAPAと名付け、siPLK1を脳腫瘍細胞に直接届けることを目的とした。

このキャリアは、研究室で特許取得済みの陽イオン性ポリマーPAH-AMを基盤としている。研究者らは、DMTMMを縮合剤として用い、メタノールを基盤とした反応でポリエチレングリコールを接合した。トリエチルアミンを加えた後、温度を3〜5℃に保ち22時間放置した。その結果、遠心分離とアセトニトリル洗浄後の精製により、黄色の固体となったPAH-AM-PEGが得られた。

次に、Motif Biotech社から供給されたApoE(159-167)ペプチドを接合した。研究者らは、3gのPAH-AM-PEGをメタノールに溶解し、PBS-メタノール溶液中にペプチドを混合した。室温で43時間放置し、48時間の透析後、凍乾によりふわふわとしたPAPA粉末が得られた。

siPLK1のロードには、静電気自己集合を用いた。研究チームは、DEPC処理済み水に10mgのPAPAを溶解し、滅菌フィルターで濾過した後、1:1〜3:1の比率で0.04mgのsiRNAとインキュベートした。最適な結合は、1%のアガロースゲルで100Vで30分間走電した結果、2.5:1の質量比以上で確認された。UV下で観察したゲルでは、siRNAが完全に保持されていることが確認された。

Malvern Zetasizer Nano ZSによる粒子特性分析では、送達に適したサイズとゼータ電位が確認された。走査型電子顕微鏡でナノ構造の形態が観察された。放出試験では、FAMラベル付きsiPLK1がPBS（pH 7.4）中の透析バッグから徐々に漏出し、488/518nmの蛍光測定で24時間にわたる累積放出が追跡された。

安定性は特筆すべき点である。PAPAは、37℃で10μg/mLのRNase AからsiPLK1を守った。ゲル検査では、自由なsiRNAは数時間で分解されたが、ナノ粒子は6時間まで保護した。血清安定性試験により、さらに耐性が確認された。

このシステムは、 Wuhan Pnosay社の胎児牛血清を含むRPMI-1640で培養されたU87MGヒト膠質腫瘍細胞を標的とする。実験モデルとして、Yangzhou大学から6〜8週齢のBALB/Cマウスが用いられた。使用された機器には、東京のOlympus顕微鏡とニューヨークのThermo Fisher PCR装置が含まれる。siRNA配列は、siPLK1のセンス5′-CCCGAGGUGCUGAGCAAGAAAdTdT-3’、アンチセンス5′-UUUCUUGCUCUCAGCACCUCGGGGdTdT-3’。負のコントロールとして、ランダム化された配列のsiNCが使用された。

膠質腫瘍は、脳血脳関門の障壁により依然として致命的な病気である。PAPAではApoEの模倣により、脳への侵入が向上している。PLK1の阻害は、癌細胞の有糸分裂を妨げる。初期データでは、PAPA@siPLK1が腫瘍を効果的に縮小することが示唆されている。完全なin vivoの結果は、今後の発表を待つ。

AAPS PharmSciTech誌の研究によると、このプラットフォームは標的療法の進展に寄与している。研究者たちは、合成収率からゲルシフトに至るまで、各ステップを最適化した。蛍光性のCy7とFAMラベルを用いて、細胞およびマウスにおける送達を追跡した。